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• 免费试用产品申领规范：

1.   申领对象：欢迎申领健吉跃的免费试用产品。健吉跃所有产品，包括免费试用产品，仅限于专业人员的科学研究用，非专业人员不得申领。

2.   使用范围：健吉跃所有产品，包括免费试用产品，仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

3.  申领个数：免费试用产品仅限于试用的目的，对于任何一种免费试用产品，只能申领1个，但可以同时申领多种免费试用产品。

4.  申领次数：免费试用产品仅限于试用的目的，每个实验室对于相同的免费试用产品仅限申领一次。

5.  运费：如果单独申领免费试用产品，运费由申领人承担。如果在订购产品时申领，运费和所订购产品合并计算。

• 质量保证与免责声明：

1.   我们保证向用户提供完全合格的产品。如您认为产品确实存在质量问题，请在收到产品7个工作日内并且产品使用量没有超过一半前以书面方式发送电子邮件至jjy@jianjiyue.cn，否则将不予受理或赔偿。同时产品赔偿只限于产品价值本身，不涉及其他任何损失。如果您的样品非常珍贵，请务必先使用适当的阳性对照进行检测，在检测体系建立起来以后，再检测您珍贵的样品。

2.  若因用户贮存或使用不当所引起的质量投诉，我们不予承担责任。除质量原因外的其它任何问题，例如缺乏使用某种试剂盒所需的仪器，订购错了试剂盒等，我们不承担任何责任，也不接受非质量原因引起的客户投诉。

3.  如发现产品有任何缺漏或破损，请在收到产品后2个工作日内通知我们。

4.  我们提供的所有产品仅限于专业人员的科学研究使用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。如有单位或个人擅自改变我们产品的用途，或存放于不适当的地方，我们不承担任何责任。

LightSpeed^TM DNA Assembly Mix Plus

货号：EZ22046S              规格：50T                 保存：-20℃保存

产品简介：

基于重组原理的无缝克隆技术，作为新一代的克隆方法，不依赖繁琐的酶切、连接步骤，也不需要末端补平等操作，依据DNA片段与线性化载体末端的15~25nt同源序列的重组，可将插入片段克隆至任意线性载体的任意位点，载体自连背景极低，是一种简单、快速、高效的DNA定向克隆技术。

LightSpeed^TM DNA Assembly Mix Plus无缝克隆试剂盒，一次反应可完成单至多个DNA片段的重组，最快仅需5分钟即可完成单片段重组，且阳性率高于95%。Mix中添加的辅助因子，有效提高克隆阳性率；经优化的反应体系，能够一定程度上耐受未纯化PCR产物中含有的杂质。升级版的无缝克隆试剂盒具有更高的阳性率、更好的兼容性。

产品组成：

储存条件：

-20℃条件下保存，有效期至少24个月。

使用方法：

1. 实验流程概要

2. 线性化克隆载体制备

选择合适的克隆位点，对载体进行线性化，载体的线性化可以通过酶切或反向PCR扩增完成。

①酶切制备

推荐使用LightSpeed^TM快速内切酶进行双酶切，使载体线性化完全，以降低转化背景（假阳性克隆）；若使用单酶切进行线性化，可以适当延长酶切时间以减少环状质粒残留。

注1：经双酶切进行线性化的载体无需去磷酸化，经单酶切则需要去磷酸化；

注2：酶切完成后，应将快速内切酶失活或对目的产物纯化后再用于重组反应。

②反向PCR扩增制备

为减少扩增突变的引入，推荐使用高保真PCR Mix进行扩增。推荐使用预线性化质粒作为模板，以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。

2. 插入片段PCR引物设计

PCR引物的5'端必须包含与其相邻片段（插入片段或载体）末端同源的15~25nt（推荐18nt）序列。假如载体为粘性末端，且3'端突出，则引物设计必须包含突出部分；若5'端突出，则引物设计可以包含突出部分，也可以不包含。

插入片段正向扩增引物：

5'—上游载体末端同源序列+酶切位点（可选）+基因特异性正向扩增序列—3'

插入片段反向扩增引物：

3'—基因特异性反向扩增序列+酶切位点（可选）+下游载体末端同源序列—5'

注1：尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆，当载体克隆位点上下游25nt区域内GC含量为40%~60%时，重组效率最高；

4. 插入片段的PCR扩增

推荐使用高保真PCR Mix进行扩增，以减少扩增突变的引入。建议使用纯化后的PCR产物进行无缝克隆反应，若PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异性扩增产物，可直接使用，但加样体积不应超过总反应体积的20%。

5. 重组反应

①于冰水浴中配置以下反应体系：

a. 最适载体用量（ng）=0.02×载体碱基对数，即0.03pmol。

b. 插入单片段，最适片段用量（ng）=0.04×片段碱基对数；插入多片段，每片段最适用量（ng）=0.02×片段碱基对数。

重组反应体系配制完成后，用移液枪轻轻吸打混匀各组分，避免产生气泡，切勿涡旋。

②将反应体系置于50℃，反应5~60分钟。

注1：推荐使用PCR仪等温控比较精准的仪器进行反应，反应时间不足或太长克隆效率均会降低；

注2：插入1~2个片段时，推荐反应时间为5~15分钟；插入3~5个片段时，推荐反应时间为15~30分钟；

注3：当载体骨架在10kb以上或插入片段在4kb以上时，建议延长反应时间到30~60分钟；

注4：50℃反应完成后，建议进行瞬时离心，将反应液收集至管底。

③将反应液离心管置于冰上冷却，之后进行转化或者储存于-20℃。

注：-20℃储存的重组产物，建议在1周内使用。

1. 重组产物转化

取5~10μL反应液，加入到100μL感受态细胞中，缓慢吸打混匀，冰上放置30分钟。42℃热激45~60秒，冰浴5分钟。加500μL SOC或LB培养基，37℃振荡培养40~60分钟（200rpm）。将菌液均匀涂布在含有对应抗生素的平板上，倒置于37℃过夜培养。

注1：不同感受态细胞最后的克隆阳性率会有所差别，推荐使用转化效率>10⁸CFU/μg的感受态细胞；

注2：菌落数取决于PCR产物与线性化载体的数量和纯度；

注3：阳性对照平板通常生长大量白色单菌落，阴性对照平板只生长很少的菌落。

2. 阳性克隆检测

挑取单菌落至10μL ddH₂O中混匀，95℃裂解10分钟后，取1μL裂解液作为模板，进行菌落PCR鉴定，或将单菌落接种至抗性培养基中培养过夜后，提取质粒进行酶切鉴定。

阳性对照的阳性克隆检测，菌落PCR引物使用通用引物M13F与M13R，酶切鉴定用HindIII与EcoRI。

注1：菌落PCR时建议至少使用一条通用引物，避免假阳性结果；

注2：必要时可进一步对阳性结果进行测序鉴定。

注3：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

      M13R：CAGGAAACAGCTATGAC

EZ22046S-02 LightSpeed系列  DNA Assembly Mix Plus 50T.docx